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  Letzte Aktualisierung
17. November 2017
Forschungsprojekte der Arbeitsgruppe Grosche
Müllerzellen, die wichtigsten Makrogliazellen der Netzhaut (Abb. 1A oder Animation), sorgen dafür, dass die Netzhaut trotz verschiedener Herausforderungen, wie beispielsweise einem ausnehmend hohen Energiebedarf und einem hohe Maß an oxidativen Stress, hocheffektiv arbeitet. Sie durchspannen mit ihren Stammfortsätzen die gesamte Dicke der Netzhaut. Eine Vielzahl verschiedenster Seitenfortsätze und Membranspezialisierungen ermöglicht ihnen eine enge Interaktion mit allen retinalen Neuronen sowie den intraretinalen Blutgefäßen. Müllerzellen übernehmen typische Funktionen, die im zentralen Nervensystem von verschiedenen Glia-Subtypen, wie Astrozyten und Ependymzellen vermittelt werden und könnten deshalb auch als eine Art "Modellglia" betrachtet werden. Sie unterstützen beispielsweise den Stoffwechsel retinaler Neuronen, recyceln Neurotransmitter und tragen zum Erhalt der Ionen-, Flüssigkeits- und Volumenhomöostase der Netzhaut bei. Abgesehen von diesen typischen "glialen", Nervenzell-unterstützenden Aufgaben, können Müllerzellen höchstwahrscheinlich durch Freisetzung von sogenannten Gliotransmittern (z.B. Substanzen wie Glutamat und ATP) die neuronale Informationsverarbeitung modulieren. Zudem dienen Müllerzellen auf Grund ihrer speziellen Morphologie bzw. ihren besonderen biophysikalischen Eigenschaften als lebende Lichtleiter innerhalb der inversen Säugernetzhaut und leiten Licht, welches auf die Netzhautoberfläche trifft zu den lichtsensitiven Photorezeptorzellen weiter – ein Prozess, der vor allem für das Dämmerungssehen mit der peripheren Netzhaut von großer Bedeutung sein könnte.

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Abb. 1 Müllerzellen in der vaskularisierten Netzhaut.
(A) Schematische Darstellung der zellulären Zusammensetzung der Säugernetzhaut. Die Zellkörper der retinalen Neuronen (blau) ordnen sich in drei nukleären Schichten an – der Ganglienzellenschicht (GZS), der inneren Körnerzellschicht (IKS) und der äußeren Körnerzellschicht (ÄKS). In Letzterer liegen dicht gepackt die Zellkörper der lichtsensitiven Photorezeptorzellen (P) und befinden sich damit auf der dem Licht abgewandten Seite der Netzhaut. Die synaptischen Kontakte zur Informationsweiterleitung zwischen Photorezeptoren und Bipolarzellen (B) sowie zwischen Bipolarzellen und Ganglienzellen (G) werden in den äußeren bzw. inneren plexiformen Schichten (ÄPS, IPS) gebildet. Neben Müllerzellen (orange) als wichtigste Makrogliazellen der Netzhaut gibt es in der vaskularisierten Netzhaut Astrozyten (nur in der GZS lokalisiert, gelb) sowie Mikroglia (immunkompetente Zellen der Netzhaut, grün), die primär in den plexiformen Schichten zu finden sind. ÄLM, äußere limitierende Membran; ILM, innere limitierende Membran; RPE, retinales Pigmentepithel; PRS, Photorezeptorsegmente; SRR, Subretinalraum. Modifiziert nach Reichenbach und Bringmann, 2010.
(B) Hochspezialisierte Morphologie einzelner Müllerzellen der Mausnetzhaut. ÄSF, äußerer Stammfortsatz; IFS, innerer Stammfortsatz; MS, Membranscheiden; PSF, perisynaptische Fortsätze. Größenstandard, 20 µm.
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Projekte
Müllerzellgliose – Freund oder Feind für das Überleben benachbarter Nervenzellen?
Wann immer es zu pathologischen Veränderungen der Netzhaut kommt, zeigen Müllerzellen typische Veränderungen ihrer physiologischen Eigenschaften und eine veränderte Freisetzung von potentiell neurotrophen Substanzen. Nach wie vor wird über die Bedeutung dieser glialen Reaktionen (der sogenannten gliotischen Aktivierung) kontrovers diskutieret. Einige Autoren sehen darin eine für das Gewebe bzw. für dessen Regeneration langfristige gesehen schädliche Reaktion der Gliazellen, während andere auf neuroprotektive Aspekte hinweisen. Wir konnten zeigen, dass eine gliotische Aktivierung von Müllerzellen mit einer Reduktion derer Kaliumleitfähigkeit einhergeht, was beispielsweise in einer verminderten Fähigkeit zur Volumenregulation der Zellen resultiert (Abb. 2). Letzteres wiederum hat zur Folge, dass Müllerzellen ihrer Rolle beim Erhalt der Ionen- und Volumenhomöostase in der Netzhaut nicht mehr im vollem Umfang gerecht werden können – eine gliale Funktionseinschränkung, die letztlich eine gestörte Informationsverarbeitung der Nervenzellen bis hin zur generellen ödembildung im Gewebe nach sich ziehen kann.
Obwohl wird wir mit unseren Studien einzelne Veränderungen der Müllerzellen während einer Netzhautpathologie umfassend charakterisieren konnten, ist nach wie vor unklar wie sich ein jeder dieser adaptiven Prozesse auf das überleben oder die Regeneration retinaler Nervenzellen auswirkt. Noch ist keine zufriedenstellende Antwort auf die Frage gefunden, warum Gliazellen z.T. so drastisch auf eine Gewebeschädigung reagieren – um den ebenfalls veränderten Bedürfnissen der umliegenden "gestressten" Nervenzellen besser gerecht zu werden, oder um ihr eigenes Überleben unter kritischen Bedingungen zu sichern (und möglicherweise auch den Weg für eine Neubildung von Nervenzellen aus den so dedifferenzierten Müllerzellen zu ebnen)?
Ziel der laufenden Projekte ist es die Bedeutung der verschiedenen Aspekte der Müllerzellgliose zu verstehen, um darauf basierend Ansatzpunkte für neue Therapien, welche eine Modulation der Müllerzellgliose zum Ziel haben, zu entwickeln.

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Abb. 2 Müllerzellen in der gesunden und kranken Netzhaut.
Links, immunhistologischer Nachweis der veränderten Expression des Gliosemarkers GFAP im fixierten Netzhautschnitt. Als allgemeiner Marker für Müllerzellen (MZ) diente das cellular retinaldehyde binding protein (CRALBP).
Mitte, Setup zur Untersuchung der Fähigkeit der Volumenregulation von Müllerzellen im vitalen Netzhautschnitt. Im Inset ist der Zellkörper einer Müllerzelle, welcher mit dem Vitalfarbstoff Mitotracker Orange sichtbar gemacht wurde, zu sehen.
Rechts, Daten, welche mit diesem Setup erhoben wurden. Während normale Müllerzellen trotz hypotonem Stress nicht schwellen, schwellen gliotische Müllerzellen sofort an. Fügt man der hypotonen Lösung aber den vascular endothelial growth factor (VEGF) zu, wird die Volumenregulatin der Zellen stimuliert – auch die gliotischen Zellen schwellen nicht mehr an.
Bedeutung der Gliotransmitter in der gesunden und kranken Netzhaut
Über die funktionelle Relevanz der Gliotransmitterfreisetzung in der Netzhaut und deren Einfluss auf die Integrität des Nervengewebes wird nach wie vor kontrovers diskutiert – vor allem hinsichtlich deren Beteiligung an der schnellen neuronalen Informationsverarbeitung). In den letzten Jahren haben wir uns vornehmlich der Frage zugewendet, welche autokrinen Funktionen Gliotransmitter wie Glutamat und ATP in der Physiologie Müllerzelle haben. Müllerzellen verfügen über eine komplexe glutamaterg-purinerge Signalkaskade. Deren Aktivierung in gliotisch veränderten Müllerzellen führt zur Wiederherstellung der (durch die verminderte Kaliumleitfähigkeit herbeigeführten) insuffizienten zellulären Volumenregulation unter hypoosmolaren Bedingungen. Im Rahmen dieser Signalkaskade werden die neuroaktiven Transmitter Glutamat, ATP und Adenosine von den Gliazellen freigesetzt.
Wir konnten zeigen, dass Glutamat sowohl exozytotisch als auch über noch unbekannte alternative Mechanismen freigesetzt wird (Abb. 3). Dagegen konnte für ATP zumindest im Rahmen der Volumenregulation von Müllerzellen eine vesikuläre Freisetzung ausgeschlossen. Viel mehr deuten Daten aus pharmakologischen Untersuchungen auf eine Beteiligung von durch Konnexine gebildete "Hemichannels" hin. Unser weiteres Interesse gilt der Frage, inwieweit sich das Muster der Transmitterfreisetzung aus den Gliazellen während akuten oder chronischen Netzhautschädigung ändert. In der Literatur wurde schon mehrfach die Beteiligung "glialen" Glutamats an der zytotoxischen Übererregung von Nervenzellen im Rahmen von ischämischen oder epileptischen Ereignisse diskutiert. Das Verständnis dieser Prozesse wird helfen, die Rolle der Glia im Rahmen von Netzhauterkrankungen besser einordnen zu können – ein Grundvoraussetzung um gezielt therapeutisch eingreifen zu können.

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Abb. 3 Exozytosiche Glutamatfreisetzung aus Müllerzellen.
Links, Grundvoraussetzung für eine vesikuläre Transmitterfreisetzung ist unter anderem die Bildung des SNARE-Komplexes. Dieser entsteht durch Interaktion von vesikulären SNARE-Proteinen (z.B. Synaptobrevin) und Proteinen der Plasmamembran (SNAP25/Syntaxin). Durch diese Proteininteraktion werden mit Transmitter beladene Vesikel an die Membran gebunden und setzen bei einem intrazellulären Kalziumanstieg ihren Inhalt frei.
Rechts, in einem transgenen Mausmodell wurde spezifisch in Müllerzellen das Botulinum-Neurotoxin (BoNT) exprimiert. Dieses spaltet das vesikuläre SNARE-Protein, eine potentielle Vesikelfusion mit der Zellmembran und die damit einher gehende Transmitterausschüttung kann nicht stattfinden.
Mitte, Detektion der Glutamatfreisetzung, welche durch einen UV-getriggerten Kalziumanstieg in isolierten Müllerzellen ausgelöst wurde. Zellen, die BoNT exprimierten, setzten deutlich weniger Glutamat frei, d.h. Müllerzellen können tatsächlich, ähnlich wie Nervenzellen, Glutamat über kalziumabhängige Exozytose freisetzen. ADE, arbiträre digitale Einheit.
Die besonderen Müllerzelleigenschaften für innovative therapeutische Ansätze nutzen
Bedenkt man die vielfältigen Funktionen von Müllerzellen, ihre besonderen morphologischen Eigenschaften und ihre gute Zugänglichkeit (ausgehend sowohl vom Glaskörper als auch vom Subretinalraum), so scheinen Müllerzellen ein ideales Ziel für innovative Therapieansätze zu sein. Entsprechend wird das Anliegen unserer zukünftigen Forschung neben dem besseren Verständnis der Müllerzellreaktion auf eine Netzhautpathologie, auch jenes sein, die Zellen durch Einsatz verschiedener etablierter Vektorsysteme (z.B. viralen Vektoren) in ihrer Genexpression so zu beeinflussen, dass ihre typische gliotische Adaption während einer Netzhauterkrankung in Richtung einer neuroprotektiven Reaktion verändert wird. Alternativ, sollen neuroprotektive Faktoren in Müllerzellen überexprimiert werden um ein besseres Überleben oder gar eine Regeneration von retinalen Nervenzellen zu unterstützen.
Methodenspektrum
  • Kalzium-Imaging am vitalen retinalen Flach- und Schnittpräparat
  • Analyse der Fähigkeit zur Volumenregulation von retinalen Zelltypen im vitalen Netzhautpräparat
  • Freisetzung von Gliotransmittern aus einzelnen, akut isolierten Müllerzellen
  • Detektion der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in isolierten Zellen der Retina
  • Standardtechniken der Immunhistologie und Molekularbiologie
  • Transgene Mausmodelle
Mitarbeiter
  • Prof. Dr. rer. nat. Antje Grosche
  • Dipl.-Biol. Lysann Wagner
  • Dirkje Felder